با عنوان :  ارزیابی اظهار ژنهای λ-Red در سویه های E.coli, Vibrio Cholerae

در ادامه مطلب می توانید تکه هایی از ابتدای این پایان نامه را بخوانید

و در صورت نیاز به متن کامل آن می توانید از لینک پرداخت و دانلود آنی برای خرید این پایان نامه اقدام نمائید.

دانشگاه آزاد اسلامی

واحد دامغان

دانشکده: علوم پایه، گروه زیست شناسی

پایان­نامۀ کارشناسی ارشد (M.Sc)

گرایش: میکروبیولوژی

  عنوان:

ارزیابی اظهار ژنهای λ-Red در سویه های E.coli, Vibrio Cholerae

& Shigella dysentrieaeجهت بهینه شدن نو ترکیبی همسان

 استاد راهنما:

دکترسيد محمود امين مرعشي

 استاد مشاور:

دکتر رضا نظام زاده

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده درج نمی گردد

تکه هایی از متن به عنوان نمونه : (ممکن می باشد هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود اما در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل می باشد)

فهرست مطالب

عنوان         صفحه

چکیده 1

فصل اول: مقدمه

1-1 انتقال ژن در باکتری.. 3

1-2 ترانسفورماسیون. 4

1-3 نوترکیبی.. 5

1-4 تعریف PCR.. 7

1-4-1 کاربردهای PCR : 10

1-4-2 تهيه ی نسخه های متعدد از يک ژن. 10

1-4-3 مراحل آزمایشگاهی PCR.. 10

1-5 Real-Time PCR ‏……………………. 11

1-5-1کاربردهای Real Time PCR.. 11

1-5-2 اصول کارReal Time PCR.. 12

1-5-3روش کار Real Time PCR.. 12

1-5-4 آنالیزهای کمی در Real time PCR.. 13

1-5-5 روش منحنی استاندارد(مقایسه مطلق) 13

1-5-6 روش آستانه نسبی(مقایسه نسبی) 13

1-6E.coli 14

1-6-1 خصوصیات عمومی.. 14

1-6-2 تقسیم‌های دوتایی و پیاپی E.coli 15

1-6-3 کاربردها 15

1-6-4 تشخیص آزمایشگاهی باکتری E.coli 16

1-7 Shigella. 16

1-7-1 تشخیص آزمایشگاهی باکتری Shigella. 16

1-7-2 بیماری زایی.. 17

1-8 Vibrio Cholerae. 17

1-8-1 شناسایی و طبقه بندی.. 18

1-8-2 فیزیولوژی.. 19

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را در شماره بندی انتهای صفحه بخوانید              

1-8-3 عوامل موثر در بیماری زایی.. 19

1-8-4 تأیید بیوشیمیایی.. 19

1-8-4-1واکنش بر روی محیط TS یا KIA.. 20

1-8-4-2 تست­های دکربوکسیلاز- دهیدرولاز. 20

1-8-4-3 تست نیاز به نمک برای رشد. 20

1-8-4-4 حساسیت به ترکیب ویبریواستاتیک 129/O.. 20

شما می توانید مطالب مشابه این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید                     

1-9 رشد و نمو باکتریها 20

1-10 زمان تقسیم سلولی.. 21

1-11 مراحل رشد و منحنی رشد باکتریها 21

1-12 منحني رشد باكتريايي.. 21

1-12-1 مرحله­ی خفته یا تاخیری (Lag phase) 22

1-12-2 مرحله ی فعال تکثیر یا رشد و تکثیر لگاریتمی (Logphase) 22

1-12-3  مرحله ی سکون یا تکثیر کند (Stationary phase) 22

1-12-4 مرحله ی زوال یا مرگ (Deathphase) 23

1-13سرعت رشد و زمان نسل. 23

1- 14 محاسبه زمان نسل باکتری.. 23

1-15 شيوه هاي سنجش تعداد سلول. 24

1-16 محیطهای کشت.. 25

1-16-1محیط كشت مایع. 25

1-16-2 محیط كشت جامد. 25

1-17اهداف کلی.. 25

1-18 اهداف اختصاصی.. 25

1-19 پرسش­هاي تحقيق. 26

1-20فرضيه هاي تحقيق. 26

فصل دوم: سابقه و پیشینه

2-1 تاریخچه ترانسفورماسیون. 28

2-2 سیستم نوترکیبی مبتنی برλ-Red. 29

2-3 پلاسمید PKD46 30

فصل سوم: مواد و روش ها

3-1 دستگاه‌ها 32

3-2 موادشيميايي.. 32

3-3 کيت­ها 32

3-4 ميکروارگانيسم‌ها 32

3-5 كشت سويه انتخابي.. 32

3-6 Transformation. 33

3-7 تهیه منحنی لگاریتمی.. 34

3-8 استخراج Total RNA.. 35

3-9 Reverse Transcriptase (RT-PCR) 36

3-9-1 طراحی پرایمرهای اختصاصی جهتReal-Time PCR.. 36

3-9-2 Real-Time PCR (RT-qPCR) 37

فصل چهارم: نتایج

4-1 استخراج Total RNA.. 40

4-2 نتایج Real-Time PCR.. 44

4-3 تایید پرایمرهای Real-Time PCR.. 45

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری

5-1 بحث.. 48

5-2 محدودیت ها 52

5-3 پیشنهادات.. 52

فهرست منابع و مآخذ. 53

چکیده انگلیسی.. 56

چکیده

نوترکیبی همسان فرایندی می باشد که در آن میتوان به تحریک ژنهای خاصی اقدام نمود که در نهایت با عملکرد جدید این ژنها میتوان یک ارگانیسم را به تولید یا عدم تولید یک پروتئین خاص وادار نمود. در حال حاضر تحقیقات گوناگونی هست که در آنها از نوترکیببی همسان بهره گیری می­گردد. هرچقدر این روشها بهینه­تر گردند، مسلما فرایندهای اقدامات آزمایشگاهی را تسهیل خواهد نمود، در نوترکیبی همسان قطعه ای از محصول PCR به داخل کروموزوم باکتری وارد شده و با بهره گیری از وکتورهای λ-Red قادرخواهیم بود که ژن recA را در میزبان تحریک کرده ونوترکیبی همسان را به انجام برسانیم. درمطالعات قبلی نشان داده شده می باشد که طول توالی­های انتهایی (flank) دو سر انتهای محصولPCR تأثیر مهمی در انجام نوترکیبی همسان دارد، اما انتخاب طول flank طبق قاعده و قانون خاصی نیست و محقق بایستی بصورت آزمون و خطا این طول را انتخاب نماید. در مطالعات انجام شده بر سویه های استاندارد، طول این flank میتواند از 50 تا 2000 جفت باز متغیر می باشد.

در این مطالعه آغاز باکتری های استاندارد dysentrieae Shigella,E.coli, Vibrio Cholerae در محیط غذایی کشت داده می­گردد و سپس کلنی مساوی از هر یک از باکتری ها را انتخاب و جهت استخراج totalRNA به کار میرود. پس از تهیه total RNA آن را تبدیل به total cDNA می کنیم،. جهت تعیین وارزیابی اظهار ژن l-Red از تکنیک Real-timePCR با بهره گیری از SYBR greenІ و روش Relative بهره گیری نموده و میزان اظهار ژنهای l-Red را در هر میزبان به دست خواهد داد. ژنهای l-Red ومیزان اظهار آن در میزبان های متفاوت متغیر بوده و قطعا با ارزیابی اظهار آن
می توان تا حدود زیادی طول مناسب را جهت نوترکیبی همسان تعیین نمود. در آن پایان نامه کوشش میگردد تا فرایند انجام نوترکیبی همسان در سویه های باکتری dysentrieae Shigella,E.coli, Vibrio Cholerae را تسهیل نمود. به تعبیری قرار می باشد مطالعه گردد آیا نتایج بدست آمده باعث کمک به بهبود فرایند نوترکیبی همسان میشود یا خیر؟ و واضح می باشد که هر چه میزان اظهار ژنهای l-Red بیشتر باشد، بازده نوترکیبی همسان با طول کمتر flank نیز میسرتر می باشد.

واژگان کلیدی: نوترکیبی همولوگ، ژن l-Red، dysentrieae Shigella,E.coli, Vibrio Cholerae

1-1 انتقال ژن در باکتری

در اكثر باكتري ها توراث ژنها اغلب به صورت عمودي می باشد اما قسمت قابل توجهي از آن توسط انتقال جانبي يا عرضي بين باكتري ها انتقال مي يابد. عناصر ژنتيكي متحرك مثل پلاسميدها، باكتريوفاژها و ترانسپوزون ها به همراه تغیيرات ژني مثل حذف، اضافه شدن و ترتيب دوباره ژن ها سير تكاملي پروكاريوتها را تسريع كرده اند و باعث ايجاد تغييرات در ژنوم باكتري ها و در نتيجه ايجاد تنوع ژنتيكي گردیده اند. باكتري ها با در نظر داشتن داشتن ژنوم كوچكتر نسبت به يوكاريوتها توانايي بيشتري براي به
اشتراك گذاشتن ژنوم­شان از طريق انتقال عرضي ژن توسط هم یوغی، ترانسداكشن[1] و ترانسفورميشن[2] دارند. مهمترين فرآيند هم یوغی می باشد كه طي تمـاس مستقيـم سلول با سلول اتفاق مي­افتد
(Proter 1997; Burrus 2006).

هم یوغی امكان تغيرات ژنتيكي بين باكتريها و گاه حتي بين سلولهاي يوكاريوتي را امكان پذير
مي سازد و اغلب توسط آن ژن هاي موجود بر روي « پلاسميدهاي كانژوگه» منتقل مي شوند. ترانسداكشن نوع ديگري از انتقال افقي ژن می باشد كه توسط ويروس ها و باكتريوفاژها صورت مي پذيرد. بعضي از باكتريوفاژها مي توانند به صورت يك پروفاژ به داخل كروموزوم باكتري ميزبان وارد شده و باعث ليزوژني آن شوند. پروفاژها قسمت مهمي از اكتساب افقي ژن را در DNA بسياري از باكتريها به خود اختصاص داده اند. گاهي اوقات باكتريوفاژها باعث انتقال قسمت هاي متحرك ديگري از DNA باكتري و يا قسمتي ديگر از DNA ثابت باكتري مي شوند و اين زماني اتفاق مي افتد كه خروج فاژ به صورت دقيق صورت نگيرد. اين مرحله ترانسداكشن تخصصي [3] ناميده مي گردد.

سومين نحوه انتقال ترانسفورميشن می باشد كه در آن DNA آزاد از محيط برداشته ميشود. براي پايدار ماندن DNA وارد شده به ژنوم ميزبان طي هر سه روش احتياج به يك سري مراحل حمايت كننده مثل نوترکیبی یکسان[4] مي باشد. همگان قبول دارند كه اكتساب توالي هاي جديد و توسعه ژنوم امري حياتي براي تكامل ميباشند. اين که آيا ژن هاي اكتسابي در باكتري نگه داشته مي شوند و يا اين كه چگونه باقي
مي مانند بستگي به عملكرد آن ژنها و فشار انتخابي محيط براي نگه داشتن آن دارد .( Proter 1997)

1-2 ترانسفورماسیون

ترانسفورماسیون یکی از راههای انتقال توارث به سایر باکتریها میباشد. در این روش یک تکه DNA دو رشته ای آزاد در محیط به سطح یک باکتری دیگر متصل شده و تنها یک رشته آن وارد باکتری شده و در کروموزوم باکتری میزبان ادغام می گردد. برای داخل شدن قطعه ای از DNA در درون کروموزوم، عملکرد اپرون UVrABCD (UV در اول اسم اپرون مخفف پرتو UVمی باشد ) ژن rec A بر اثر عوامل مثل uv ، عوامل شیمیایی و ورود DNA تک رشته ای به درون باکتری فعال میشود و rABCD مخفف ژنهایrecA, recB, recC و recD میباشد) این اپرون شامل ژنهای recA, recB, recC وrecD میباشد. فرآیند نوترکیبی[5] بواسطه پروتئین RecA فعال میگردد. در این فرآیند، اگر DNAتک رشته ای وارد شده در باکتری، با ناحیه ای از کروموزوم تشابه داشته باشد، تعویض میگردد که این جابجایی بواسطه پروتئین RecA انجام
می پذیرد. از طرفی ژنهایrecB, recC وrecD تأثیر تنظیمی، با عملکرد منفی بر روی ژن recA را بازی میکنند(Hamood et al., 1986).

در حال حاضر، در آزمایشگاههای تحقیقاتی، با بهره گیری از این سیستم و نحوه ادغام فاژ λ وکتوری (وکتور ها مولکول‌های DNA ای هستند که برای کلون کردن قطعات DNA در سلول های میزبان به کار می‌طریقه) را تولید نموده اند که میزان نوترکیبی را در باکتریها افزایش میدهند. در این وکتور سه ژن exo, bet وgam را تحت یک پروموتری که با L-arabinose تحریک می گردد قرار داده اند. عملکرد این سه ژن به این شکل می باشد که پروتئین Exo باعث هضم نوکلئوتیدها از قسمت 5’ انتهای DNA دو رشته ای
می­گردد و پروتئین Bet با حفاظت از قسمت تک رشته ای 3’ به وجودآمده، مانع تخریب آن میگردد. نهایتا پروتئین Gam با ممانعت از عملکرد ژنهای recB,recC وrecD باعث تحریک اظهار ژن recA در باکتریها می گردد (شکل1-1).

مارکر مقاومت آنتی بیوتیکی در این وکتور آمپی سیلین بوده و از نظر تعداد پلاسمید در باکتریها، جزء پلاسمیدهای شمارش تکرار پایین[6]محسوب میگردد. بهترین دما، برای تکثیر این وکتور 30 درجه سانتیگراد بوده و در دمای 42-37 درجه سانتیگراد از دست میرود. پس از این نظر، جزء پلاسمیدهای حساس به دما[7] نیز تقسیم­بندی میگردد (Yamamoto et al., 2009). مهمترین و کاربردی ترین پلاسمید در این زمینه pKD46 بوده که قابلیت تکثیر، در dysentrieae Shigella,E.coli, Vibrio Cholerae را دارد.

شکل (1-1) عملکرد ژنهای exo, bet وgam بر روی DNA دو رشته ای

1-3 نوترکیبی

نوترکیبی[8] ژنتیکی فرآیندی می باشد؛ که طی آن مولکول اسیدنوکلئیک شکسته شده و به شکل­های مختلف به یکدیگر متصل می شوند. این اقدام در بیشتر مواقع مربوط به DNA و گاهی درRNA نیز دیده
می گردد. نوترکیبی می تواند بین کروموزوم های همولوگ باشد که به آن نوترکیبی همسان گفته می گردد. نوترکیبی به گونه معمول روشی برای ترمیم DNA پروکاریوت و یوکاریوت ها می باشد که در یوکاریوت ها در میوز رخ داده و به آن فرآیند کراسینگ اور می گویند. در طی آن جابه جایی کروموزوم پدر و مادری رخ می دهد و می‌تواند سبب تولید الل جدید گردد. در سیستم ایمنی این فرآیند تأثیر بسیار مهمی را اعمال می­کند وسبب مقاومت بدن پیش روی بیماریزاهای مختلف می گردد.

شکل( 1-2) نوترکیبی

نوترکیبی روشی مفید در مهندسی ژنتیک به شمار می رود. از نوترکیبی می توان جهت ایجاد تغییر در نوکلئوتیدهای ژنوم باکتری ها، ویروس ها،BACs[9]،[10]PAC و پلاسمیدها بهره گیری نمود. اما خاطر نشان می گردد که نوترکیبی در محیط زنده[11] نیز انجام می پذیرد. پس برای ایجاد چنین تغییری در ژنوم می توان از نوترکیبی همسان[12] بهره گیری نمود. در نوترکیبی همسان بایستی از محصول PCR[13] که انتهاهای آن به صورت تک رشته­ای در آمده و یا از تک رشته های DNAسنتتیک بهره گیری نمود. در پروکاریوت ها میزان ایجاد نوترکیبی طبیعی 10-5-10-4 می­باشد اما میزان ایجاد نوترکیبی همسان 10-1/0 درصد می باشد. در نوترکیبی همسان مهمترین فاکتور طول قسمتهای انتهایی محصول PCR می باشد که به خاطر عملکرد محصول ژن bet صورت تک رشته ای در آمده می باشد. هر چه میزان طول ترادف های همسان بیشتر باشد بازده ی نوترکیبی همسان بیشتر خواهد بود. پدیده ی نوترکیبی همسان به واسطه ی اظهار ژنrecA در باکتری ها صورت
می گیرد. پس هر چه میزان اظهار ژن recAبیشتر باشد بازدهی نوترکیبی همسان نیز بیشتر خواهد بود (Sharan et al.,2009). نوترکیبی همسان در باکتریها بواسطه ی حضور پر رنگ اظهار ژن recA صورت
می گیرد.

اظهار ژن recAبواسطه ی اپرون recBCD. (اپرون واحد عملکرد DNAژنومی می باشد که شامل مجموعه‌ای از ژن‌های تحت کنترل یک سیگنال نظارتی یا پروموتر می باشد) کنترل و سرکوب می­گردد تا از اظهار افسار گسیخته ی آن جلوگیری گردد. کاهش اظهار ژن recA باعث کاهش میزان نوترکیبی می گردد. در نتیجه برای افزایش بازدهی آن به تحریک اظهار ژن recA به عنوان کلید حل این معما بهره گیری نمود
(Murphy et al., 2000).

سیستم نوترکیبی مبتنی بر λRed در تغییر ژن ها بسیار سودمند میباشد. شیوه های ساده ای برای غیر فعال سازی و تغییر ژنها و نوکلئوتیدها در باکتریها با بهره گیری از تکنیک بازسازی ژنتیکی سلول هست، این امر با کمک سیستم نوترکیبی λRed و محصول PCR حامل یک کاست مقاومت انتی بیوتیکی روی کروموزوم باکتری انجام می شود و هر چه طول انتهای همولوگ بیشتر باشد، بازدهی نوترکیبی همسان بیشتر خواهد بود (Yamamoto et al., 2009).

نوترکیبی همولوگ در ترمیم DNAآسیب دیده در حین همانندسازی DNA موثر می باشد. در سلول­های یوکاریوتیک میزان نوترکیبی همسان 8-16 درصد گزارش شده می باشد(Saleh Gohari et al., 2005). مطالعات نشان داد که نوترکیبی همسان در باکتری , Vibrio Choleraeباعث ایجاد سویه های زنده ضعیف شده می گردد. ژنهای mer،ctxB،hlyA بواسطه نوترکیبی همسان دگرگون شده و باکتری های وحشی تبدیل به سویه های کاربردیCVD109 گردیدند. در این پروسه توالی­های یکسان انتهایی با طول­های متفاوت 100،500،1000 نوکلئوتیدی مطالعه شده (Michalski et al.,1993). نهایتا مقالات و گزارشات نشان می دهد که هر چه میزان اظهار ژن recA بیشتر باشد، بازدهی نوترکیبی همسان نیز بیشتر خواهد بود. اما نکته مهم این می باشد که میزان اظهار ژن recA در باکتری های متفاوت نیزاختلاف نسبتا جزئی دارد، پس ارزیابی و سنجش اظهار ژن recA در بهبود و افزایش بازدهی نوترکیبی همسان مفید واقع خواهد گردید و برهمگان واضح می باشد که فرایند نوترکیبی همسان برای ایجاد واکسن و سویه های زنده ضعیف شده و همچنین ارزیابی ژنهای کنترلی مفید خواهد بود.

1-4 تعریف PCR[14]

اين تکنیک در اواسط دهه­ی 1980 بوسيله ی کری موليس معرفی گردید. به دليل کاربردها و مزيت­های بسيار زياد آن به سرعت در زيست شناسی مولکولی گسترش پيدا نمود. امروزه اين روش تقريباً در تمامی آزمايشگاهها ی زيست مولکولی جزو کارهای متداول می باشد و به صورت اتوماتيک بوسيله­ی کامپيوتر انجام می گردد.اين تکنيک تمامی معضلات قبلی در زيست مولکولی که ناشی از عدم دسترسی به مقادير زياد از DNA يکسان بود را برطرف نمود. برای مثال قبلاً برای بدست آوردن نسخه­های متعدد از يک ژن خاص می بايست اين ژن را به داخل حامل مناسب وارد کرده و در يک باکتری تکثير کنند اما امروزه اين کار را به سادگی و با بهره گیری از PCRانجام می دهند. PCR به معنی واکنش زنجیره ای پلی مراز می باشد. هدف از آن سنتز رشته هایDNA   جدید از روی رشته های الگو می باشد که به صورت زنجیر وار تکرار
می­گردد. PCR دارای انواع متعددی می باشد که یکی از آنها Real TimePCRاست. دراین روش از ژل آگارز بهره گیری نمی گردد و امروزه با دستگاه های به نام لایت سایکلر[15] که مقدار محصول در هر سیکل را نمایش می دهد بسیار ساده شده می باشد. در ساده ترین حالت از اتیدیوم بروماید[16] به عنوان رنگ تداخلی با DNA برای تعیین مقدار محصو ل تولید شده در هرسیکل می توان بهره گیری نمود. ازآنجایی که قابلیت فلورسانس اتیدیوم بروماید در حضور DNA دورشته ای افزایش می یابد، می توان از آن برای تشخیص وتعیین مقدارمحصول دورشته ای بهره گیری نمود. اتیدیوم بروماید تقریبا هیچ گونه اثری برروی مقدارو خصوصیات واکنش های PCR، ندارد پس تکثیر توالی های خاص DNA وتشخیص همزمان آن با دستگاه ترانس ایلومیناتور فرابنفش[17] امکان پذیر می گردد.

PCR از نظر اصول عملی تشابه زيادی به همانند سازی DNA دارد و در واقع برگرفته از آن می باشد . ياد آوری می گردد که DNA پليمراز DNA تک رشته ای را از جهت  5َ به  3َ به عنوان الگو مورد بهره گیری قرار می دهد ورشته مکمل را در جهت5َبه 3َمی سازد. همچنين DNA پليمراز برای شروع احتياج به يک قطعه اوليه (شناساگر) دارد.

برای انجام PCR ، DNAپليمراز ، نوکلئوتيد تری فسفات ها و پرايمر لازم هستند. از آنجائيکه DNA دو رشته ای می باشد، دو نوع پرايمر درPCR موردنياز می باشد. اين دو پرايمر دو اقدام انجام می دهند، اول اينکه محل ژنی که بايد تکثير گردد را مشخص می نمايند و دوم اينکه اندازه ی قطعات تکثير شونده را تعيين
می کنند . اقدام اول کاملاَ مشخص می باشد، در مورد اقدام دوم بايد گفت که وقتی اين دو شناساگر به دو ناحيه­ی مختلف DNA و به سمت هم قرار می­گيرند DNA پليمراز تنها قطعات را در بين اين دو ناحيه همانندسازی می­کند و به اين ترتيب طول قطعات ساخته شده تعيين می­گردد. برای شروع PCR ، DNA الگو، پرايمر ها و نوکلئوتيد تری فسفات ها و DNA پليمراز در يک لوله با هم مخلوط می شوند. سپس لوله را گرم می کنند تا دو رشته DNA از هم جدا شوند. سپس لوله را سرد می کنند تا پرايمر ها به نواحی مورد نظر متصل شوند و DNA پليمراز شروع به همانند سازی از روی DNA بنمايد. بعد از مدت زمان لازم برای همانند سازی بار ديگر پرايمرها به نواحی مکمل خود متصل شوند. زیرا در مرحله ی قبل رشته DNA در ناحيه مورد نظر مضاعف شده می باشد، در اين مرحله چهار رشته ی الگو برای همانند سازی هست و در نتيجه در پايان اين مرحله به وجودمي آيد، و در مرحله ی بعد 16 نسخه و به همين صورت بطور تصاعدی تعداد نسخه های ژن ها زياد می گردد .

در ابتدای طراحی PCR از آنزيم DNA پليمراز E.coli بهره گیری گردید اما اين آنزيم به حرارت حساس می باشد و بنابراين پس از هر بار حرارت دادن محيط واکنش تا دمای 94 درجه­ی سانتی­گراد، افزودن دوباره­ی آنزيم تازه به محيط لازم بود. يکی از مهم­ترين کشفيات در اين زمينه اين بود که باکتريهای
چشمه­های آب گرم دارای DNA پليمراز هايی هستند که نسبت به حرارت مقاوم بوده و حتی در دمای بالا فعاليت بهتری دارند . برای مثال باکتری  Thermus  aquaticus دارای DNA پليمرازی می باشد که در دمای 94 درجه ی سانتی گراد کاملاَ پايدار می باشد و همچنين دمای اپتيمم اقدام آن نيز 72 درجه ی سانتی گراد می باشد، اين DNA پليمراز که بطور اختصار Taq پليمراز ناميده می گردد باعث گردید که براحتی PCR به صورت اتوماتيک انجام گردد و با افزودن يکبار آنزيم Taq پليمراز ديگر نيازی به اضافه کردن مجدد آن نباشد .

مزيت بسيار مهم ديگر Taq پليمراز افزايش حساسيت و دقت PCR می باشد. در دمای پايين
(30 درجه سانتی­گراد) (که برای DNA پليمراز E.coli بکار می­رفت) پرايمرها ممکن می باشد به جايگاههايی که توالی تا حدودی مشابه دارند نيز متصل شوند، زيرا در دمای پايين تعداد کمتری پيوند هيدروژنی برای اتصال پرايمرها نياز می باشد. بنابراين پرايمرها با اتصال به نواحی نسبتاَ مشابه، باعث ايجاد اشتباه در انجام مراحل PCR می­شوند. اما وقتی که واکنش در دمای 72 درجه (دمای اپتيمم فعاليت Taq پليمراز) انجام گردد اتصال پرايمر ها به نواحی غير از ناحِيه­ی اصلی کاهش می­يابد. به اين صورت پس از پايان PCR
رشته های DNA کاملاَ مشابه و خالص بدست خواهد آمد. برای ديدن قطعات تکثير شده DNA می­توان براحتی از الکتروفورز برای ژل آگاروز و رنگ اميزی اتيديوم برومايد بهره گیری نمود .

تعداد صفحه :68

قیمت : چهارده هزار و هفتصد تومان

***

—-

پشتیبانی سایت :        ———-        serderehi@gmail.com